如何选择一个RNA-seq的包?

之间有什么RNA-seq的选项#121-124和133-134#,和我应该选择什么区别?

#121-124使用聚下拉用于mRNA富集,而#133-134使用rRNA基因枯竭去除核糖体RNA。

这两个工作流程保留的成绩单链信息。

If your experiment's goal is coding gene expression profiling 和 you have good quality total RNA samples (RIN>8 by Agilent Bioanalyzer), you most likely only need packages #121-124.

如果你的RNA样品降级,这意味着他们正在失去他们聚一个尾巴。因此,不管你的实验的目标,你应该选择#133-134。 

如果您的实验目标不仅是编码基因的表达也lncrnas,你应该选择#133-134,不管你的RNA质量。

应该选择配对末端(2×100个碱基),或单次读取(100 bp)的序列?

如果您的实验目标是基因表达谱,你很可能只需要一次读取软件包。 

如果你也有兴趣在检测结构的变化,选择性剪接模式,甚至是点突变时,应选择配对末端包。

我需要什么深度?

用于编码人/小鼠/大鼠的基因表达谱,30米单个读选项(#121),提供足够的覆盖范围。

如果你的目的基因在较低的数量表达建议更深的测序。

因为许多非编码RNA种类的mRNA一起发现,rRNA基因枯竭协议需要更深入的测序。

为什么有些软件包需要前置审批?

一些包装设计用于显著信息学经验的用户。我们只能为他们提供给我们已知的用户谁能够处理增加的工作量信息学没有我们的帮助。

需要前置审批的包#120,#131-132,401-402#,#421,和#431。请不与基因组中心的成员第一讲不要选择这些。

我没有为10ng输入RNA。你们提供RNA扩增服务?

If you have less than 50 ng of input RNA, we offer an option for RNA amplification using Clontech’s SMART-seq v4 Ultra Low Input RNA Kit to create amplified cDNA, followed by library preparation using Illumina’s Nextera XT kit. The minimum input required for this kit is 10 pg, but >200 pg is preferred. Please choose package #141.

If you have more than 50 ng input RNA but less than 100 ng (and RIN >8), we have had success with option #121 but cannot guarantee it will yield a sequenceable library with sufficient complexity. We can try this option 和 save 10% of your starting material to do option #141 in the event #121 doesn’t work. 

我们建议选择所有选项#141,如果所有的样品都是非常低的输入;如果你只有一个或两个较大的批次有足够的材料,低输入样本,选择尝试#121所有样品(节省投入的材料做的#141)是优选的。

你接受RNA-seq的FFPE RNA?

For degraded and FFPE RNA, we offer the TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero Gold prep (packages #133-134). This uses Ribo-Zero technology to deplete the rRNA (both cytoplasmic 和 mitochondrial), as the normal protocol will not work due to loss of the poly-A tails. We still require a Bioanalyzer report. We accept RINs of <8 for this protocol, but cannot guarantee quality as the quality of FFPE is so variable. Sequencing is required at a higher depth due to remaining non-coding RNA. (For this reason, we recommend starting at 60M paired-end reads)。


我应该如何设计我的RNA-seq的实验?

是否确定收集样品批次?

它是最好的,如果你能在一次采集样本,但它是常见的做法,研究人员收集/使用相同的协议在不同的时间提取的RNA。

我可以比较不同批次的数据?

请反复选择以比较不同意见相同的包。此外,请让我们知道在提交的时间,如果你想将当前项目与以前的项目比较,以确保我们使用相同的工具进行数据分析。

我们还包括了在每个样品中的RNA穗在控制,这可被用于归一化。

我需要的生物或技术复制?如果是这样,有多少?

是的,我们强烈建议生物学重复。我们建议为每个治疗/组至少3个生物学重复。我们不从同一样品进行技术重复文库,为新一代测序技术本身是高度可重复的。


提交样品

什么是我的样品提交要求?

请参阅 提交样品 供参考。

我需要做一个生物分析仪?会tapestation报告是否足够呢?

是(对于RNA样品),生物分析仪报告是优选的。对于RNA样品,我们需要的是,生物分析仪报告无法在提交的时间是不到一个星期以上。如果样本已经经历了冷冻/解冻循环或因为已经出货那么我们强烈建议重新运行样品。我们无法提供数据质量的保证,如果上述条件不能得到满足。

一个tapestation报告就足够了。然而,我们无法提供数据质量的保证。

生物分析仪报告不需要基因组DNA的样品,但需要cDNA样品。 

我如何bioanalyze我的样品?

有哥伦比亚用户两种选择。

研究人员可以送样到 分子病理学芯。如果您稀贵样品,请在样品名称表明这一点。

如果您想购买自己的生物分析仪试剂,您可以使用我们的生物分析仪作为一个自助服务工具。请联系 genome@columbia.edu 设立预约。这个建议只有高级用户。

外部用户可以提交对基因组中心的请求来执行生物分析仪为他们。这个服务是每个样品30 $。


定制项目/自备库

我应该怎么做,如果我的要求是不是RNA-seq的/外显子测序/全基因组测序?

如果您有兴趣的芯片序列,面板排序,或者我们没有一个全面服务的其他应用程序,我们建议准备自己的库与Illumina的平台兼容的协议,我们将竭诚为排序它们。请参阅下面的自备库的要求。

我应该怎么做自制库?

您需要正确地量化自备库,因为这是一个测序运行成功的关键。我们建议使用QPCR,或使用从生物分析仪的平均片段长度用荧光读数以计算的摩尔浓度(量子位或的PicoGreen)。

我们需要至少在10微升水中的10纳米的合并文库。我们将加载根据您的定量采样。我们需要在提交(索引和序列的名字)的时候所有的索引信息和池化图书馆的生物分析报告。请填写 自制备库的示例形式 并发送给 genome@columbia.edu.


nextseq自助服务

我怎样才能利用你nextseq服务?

你有访问太阳城平台基因组中心的nextseq能力两个选项。

1.有哥伦比亚基因组中心的工作人员运行测序。

我们会收你为我们的套件加上人工支付(见 价钱)。

我们需要至少在10微升水中的10纳米的合并文库。我们将加载根据您的定量样品。我们需要在提交(索引和序列的名字)的时候所有的索引信息和池化图书馆的生物分析报告。

 你可以创建basespace运行,并与我们分享的登录名和密码信息,使您可以直接从basespace下载数据。我们也可以通过我们的管道运行数据,并提供基本的数据分析。

2.成为nextseq器械的自用户。

成为下一个-seq的用户请:

  • 回顾Illumina的 在线视频教程用户指南.
  • 创建或熟悉实验室的basespace帐户。
  • 观察另一个自我用户设置运行。 (如果你没有一个实验室部件来观察,请与我们联系。)
  • 让我们知道,当你第一次运行的。如果你是无助的,我们将帮助您设置仪器。请联系Illumina公司的basespace建立和支持(techsupport@illumina.com 或1-800-809-4566)。

一旦您已成功完成第一次运行,我们会把你加入到我们的用户列表,并建立钥匙卡进入房间测序。


测序后的问题

什么是您的周转时间?

在过去的一年中,我们的平均周转时间为标准RNA-seq的已经2-3周从我们收到您的样品到我们所提供的数据的时间。

如果你需要在某个日期交付项目,请与我们联系,我们可以试着给你适应尽我们的能力。请让我们在提交的时候知道这个,所以我们可以合理的规划。

你有什么成果?

RNA测序(人/小鼠/大鼠/ celegans /兔/斑马鱼/酵母/ dropophila)

的fastq,咣当,如果样本组信息给出计数表,差异表达的基因名单

全基因组测序(人)

的fastq,BAM,和VCF(种系的变体)

全基因组测序(人)

的fastq和巴姆

你如何释放数据?请问您存储数据?我们可以得到我们的样品回来?

我们会给你一个网站链接,下载数据。也欢迎您带过来一个硬盘驱动器,我们可以将数据传送到驱动器。

它被永久删除之前的数据将被存储在我们的服务器上为1个月。

剩余的样品将被丢弃之前被储存1周。数据发布的电子邮件将有一个注,表明你可以拿起任何剩余的样品材料。我们将存储库6个月,之后,他们将无预警被丢弃。