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2016年10月31日

自动化,单细胞RNA测序使得对肿瘤生态学研究

彼得·模拟人生 & 锦州元

助理教授彼得·西姆斯和博士后研究员锦州元显示他们对自动化单细胞转录组测序平台。照片:林恩萨维尔。

RNA测序(RNA-seq的)已经成为主力技术在系统生物学研究。不像基因组测序,揭示样品的DNA蓝图,RNA-seq的编目不断变化的转录;也就是说,它逐条列出并量化成套信使RNA转录存在于细胞在特定时间和特定条件下的。这样,转录组测序能够研究如何在基因组编码的信息功能转化为可观察到的特征,以及用于定义和比较不同的生物状态提供了宝贵的数据。

常规RNA-SEQ产生mRNA丰度的在所有细胞的样品中的平均摘要。最近的研究,但是,创造了能够在单细胞水平产生mRNA分布型的更高分辨率的技术需求。在癌症生物学,例如,有一个日益尖锐认识到在构成恶性肿瘤细胞的基因表达是高度异质性。这表明,为了理解细胞如何共同促成肿瘤的癌细胞的行为,科学家需要表征,其中它是由细胞组成的整个生态环境更好的方法。能够量化的细胞基因表达细胞差异可能是探讨这样复杂的环境,并了解他们是如何维持恶性一个有价值的方法。

虽然有几个单细胞转录组测序技术已经在过去两年中已经亮相,他们是昂贵的操作,而不是优化生产上所需的系统生物学的研究,特别是在组织标本细胞数量有限规模的数据。在 新的纸张刚刚发表在杂志 科学报告然而,研究人员在系统生物学助理教授系实验室 彼得·模拟人生 描述了一种新的办法,比其他现有的方法提供了几个重要的优点。

新的,自动化平台建立在所述SIMS实验室以前的创新提供以同时从单一组织样品测量数千个单独细胞的基因表达一种廉价,高效,可靠的方式。使用定制设计的微孔板,微流体,温度控制系统和软件,该技术捕获,标记,并产生在每一个小区中的完整的转录组的读出,从而提供随后可被分析以区分在小区之间的功能多样性的健壮数据样品。目前,该技术正在发挥系统生物学部门正在开展的几个研究项目中起关键作用,并承诺为单细胞基因组学领域的不断发展,以变得更加强大。

技术如何工作

的SIMS实验室的方法的基础是使用由PDMS,一种类型的硅橡胶制成的定制板。板可以包含多达150000个微小孔,每个阵列具有只是100皮升的体积。后从组织样品的单个细胞已经分离并悬浮在溶液中,微流体装置通过该悬浮液在板和单个细胞沉降为单井由于重力。然后在各孔中装入覆盖有百万具有特定珠子的核苷酸序列的寡核苷酸的拷贝的聚合物珠粒。

Single cell RNA-Seq workflow

模拟人生实验室的自动化单细胞转录组测序平台的示意图。后的单细胞从溶液到各个孔中沉降,条形码珠被插入,所述细胞经过裂解,和微孔与油密封。从每个细胞mRNA的经过反转录和所得cDNA被标记有所述寡核苷酸条形码。在实验过程中,该板可被移除以观察的东西,如细胞大小和形状,荧光标记物的表达,以及约待测序的细胞的健康。礼貌 科学报告.

一旦珠子在孔中加载,将细胞暴露于导致它们破裂的化学品,并且整个微孔阵列与油的薄层以防止孔之间的交叉污染密封。所释放的mRNA分子,然后通过寡核苷酸捕获并暴露于引起逆转录另一反应。所得到的互补DNA(cDNA的)结束与特定珠的核苷酸序列标记并粘到胎圈。因为寡核苷酸序列是唯一的单井单细胞,它作为以后可以用来识别从哪个特定的基因来了特定小区的“条形码”。

此条形码的好处是,而非测序细胞一次一个,所有的珠粒然后可以从微孔板上移开并在一个管混合在一起。它们经受用于分隔珠的寡核苷酸cDNA分子,然后cDNA的整个池在相同的时间在所述测序另一反应 太阳城平台基因组中心。当通过标准的Illumina测序仪运行,科学家们然后生成,其中每个分子的序列包含它的条形码读出。在此聚合揭示了各单捕获的细胞的独特转录。

这种一般方法,最初由实施 sayantan玻在模拟人生实验室担任博士后研究的科学家,是 首次出版 在自那时以来,2015年,该实验室欢迎 锦州元,一个博士后,其背景是在工程和谁开发自动化工作流的方法。新平台刚刚报道 科学报告 使得该方法快速,易于使用,并且能够有效地制备细胞RNA测序以高通量方式进行。

独特的优势和机遇

模拟人生实验室的方法比其他现有技术的一些重要优势。一,汇集方法从成千上万的细胞同时测序基因,以及该工具的定制性质,意味着它是远远低于其他更广泛的商业平台来操作昂贵。新的高通量微流控的设置能够为每单元只有10美分制备单细胞RNA-seq的库。这是对于具有高细胞异质性生成从组织样本统计稳健单细胞数据的巨大的优势。

新的自动化也导致了在与科学家们可以从珍贵的组织样本捕获细胞的效率得到显着提高。最新的纸张报告,被初始加载到微流控装置的单元的50%以上,可以通过微孔被捕获。 “我们设置了使平台更易于使用,”模拟人生说,“但经常发生,当你实现自动化,我们也得到了性能上的显着增加。该技术的增强能力意味着它产生更好的数据“。

模拟人生实验室的平台的最后一个重要的优势,其使用固态微孔板细胞捕获派生。其他竞争实验技术已经试图解决在油滴包裹他们单细胞分离的问题。这些方法,但是,不允许研究者在用于质量控制的装置中的图像单元发送它们用于测序之前。

“单细胞基因组学的未来在于整合多个观测......我们认为我们应该很好地参与在该领域的发展方向。”

在模拟人生实验室的工作流程的不同阶段,可以移除板,看看它在显微镜下,提供了一个机会确认,例如,使得多个小区都没有一个很好粘在一起,并且是对细胞被测序的是健康的。微孔阵列也使得有可能在平行于同一小区执行额外的实验,例如用荧光探针染色他们收集表型信息。这将打开大门,进行更复杂的,综合性实验,可能导致微妙的见解进入细胞的多样性正在研究中。

西姆斯解释说,一些研究的系统生物学的部门正在计划这种能力是必不可少的。 “这是越来越明显,”模拟人生解释说,“这单细胞基因组学的未来在于除了基因整合多个观测。因为我们能够在我们的实验中微孔隔离和做事的细胞,我们认为我们应该很好地参与在该领域的发展方向。”

解剖脑肿瘤,一个细胞在一个时间

已经模拟人生实验室的单细胞转录组测序技术已经吸引了从系统生物学和太阳城平台医学中心(CUMC)的其他角落的部门其他科学家的兴趣。作为一个参与调查 中心癌症发展和异质性的拓扑,美国国家癌症研究所的物理科学,肿瘤学网络(PSON),模拟人生为重点解剖在胶质母细胞瘤(GBM)细胞的异质性项目的重要球员,脑癌的最常见和最致命的形式在中心。 

该项目依托的协作显着跨学科的团队中,开始的时候神经外科医生 杰夫·布鲁斯 脑外科手术时要收集GBM组织。他将这些样品 彼得canoll在CUMC,神经病理学主任,使用标准病理方法谁分类组织。反过来,canoll然后将它们发送到 安娜lasorella在研究所的癌症遗传学,他的实验室在安全的离解肿瘤成单个细胞的专业副教授。它是在这一点上锦州元在SIMS实验室接收样品,然后将其通过自动测序工作流通过。

该过程的终点时,如果本单细胞转录组测序数据成为可供分析。领导这一努力 罗尔·拉巴丹在系统生物学,谁使用的概念,从被称为拓扑数据分析,归类已通过测序管道走了各个单元的数学领域的部门理论物理学家。他的方法是揭示脑瘤的组成比以前能够提供更加细致入微的方式。

“彼得·西姆斯已在哥伦比亚了创业的单细胞平台使我们能够研究一些重要的生物学问题,” rabadan说。 “这包括弥补癌症细胞的异质性。”

可扩展的,高通量,高效的技术的本质是在朝着这个科学目标移动的关键因素。 “通常情况下,”模拟人生解释说,“癌症研究人员只磨了一个肿瘤和顺序整个事情。几年前,它也成为了可以选择特定的细胞和序列少数人。现在,我们的单细胞转录组测序平台为我们提供了足够高的吞吐量,我们可以简单的序列 所有 细胞,从而提供整个肿瘤环境的无偏图像。这给我们一个什么样的实际存在,而不必尝试猜测我们应该跟踪该标记非常清晰,更客观的看法。”

虽然在这个项目胶质母细胞瘤的研究仅在2016年夏天开始,它已经很清楚,基因表达的多样性是非常丰富的实体肿瘤,这一事实会影响我们如何理解并有可能在未来治疗癌症。

在癌症系统生物学研究的一个核心组成部分

模拟人生实验室也打在最近开业的重要作用 中心为癌症治疗剂的系统(浇铸),在美国国家癌症研究所的新的癌症系统生物学联合会4个就职中心之一。在这种情况下,模拟人生不就一个具体项目的调查,但指导其分子分析的核心,这将是投科学家支持各种研究。除了单细胞RNA测序,芯还提供集成的基因组范围表达与高通量筛选,以及微流体和其他高通量单细胞测序方法仿形的平台。

在一个项目投计划的追求,例如,系统生物学椅系 安德烈卡利法诺 将首次应用于他的实验室已开发的算法 - 基因表达数据来推断其使用的监管网络模式 - 单细胞的研究。在另一个,罗尔·拉巴丹将研究如何肿瘤的细胞构成响应药物治疗和其他环境扰动,也就是耐药性的发展具有重要的一个问题,随着时间而演变。

“系统生物学是一个技术驱动的领域,这是非常合作,”模拟人生观察。 “像投通常是大的中心是围绕几个核心的科学概念和几个技术构建。我很高兴我的实验室已经能够贡献他们使其能够做这样令人兴奋的科学技术。”

— 克里斯·威廉姆斯


相关出版物 

元Ĵ,敏思PA。 自动化微孔平台大型单细胞RNA测序。 SCI代表。 2016年09月27; 6:33883。

玻色S,苍白Z,卡尔一个,里兹维啊,维埃拉克,pe'er d,模拟游戏PA。 可扩展的微流体单细胞RNA印刷和测序。基因组生物学。 2015年6月6日; 16:120。